Молекулярная ПЦР-диагностика: эталон точности в пищевой безопасности
Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени
(Real-Time PCR) представляет собой высший стандарт современной
лабораторной аналитики. В отличие от культуральных микробиологических
посевов или иммуноферментных тестов, ПЦР анализирует первичную
структуру генома целевого микроорганизма — специфические
нуклеотидные последовательности ДНК или РНК.
Ключевые преимущества метода Real-Time PCR
Абсолютная видовая селективность
Праймеры и флуоресцентно-меченые гидролизные зонды
(TaqMan) комплементарны строго определенным генам патогенности,
например гену инвазивности invA у сальмонелл
или гену гемолизина hlyA у листерий.
Ложноположительные реакции на близкородственные
сапрофитные бактерии полностью исключены.
Кинетическая детекция в закрытой пробирке
Измерение флуоресценции происходит непосредственно
в процессе термоциклирования при каждом цикле амплификации.
Пробирка никогда не вскрывается после реакции, что ликвидирует
риск переноса ампликонов и перекрестной внутрилабораторной
контаминации.
Количественная оценка (Quantitative PCR)
По значению порогового цикла (Ct)
и калибровочной кривой прибор автоматически вычисляет
исходное количество копий ДНК в миллилитре или грамме
образца с динамическим диапазоном до 7 порядков.
Преимущества лиофилизированных наборов foodproof® LyoKit
Корпорация Hygiena внедрила формат
LyoKit, в котором основные компоненты
ПЦР-реакции уже подготовлены производителем.
Сублимированная реакционная смесь в каждой лунке
На дно каждой пробирки нанесен высушенный мастер-микс,
включающий термостабильную Taq-полимеразу,
дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), буферную систему,
соли магния, специфические праймеры
и флуоресцентные зонды.
Исключение человеческого фактора при раскапывании
Лаборанту не требуется смешивать на льду несколько флаконов
с ферментами и праймерами. Для запуска реакции необходимо
внести 25 мкл выделенного раствора ДНК
непосредственно в пробирку. Лиофилизированная гранула
растворяется после внесения образца.
Хранение при температуре +2...+8°C
Лиофилизированные наборы LyoKit не требуют глубокой заморозки
при -20°C. Они стабильны в обычном лабораторном холодильнике
на протяжении 18–24 месяцев со дня производства
и сохраняют активность при транспортировке.
Встроенный внутренний контроль (Internal Control, IC)
Каждая реакционная пробирка содержит синтетическую ДНК
внутреннего контроля с флуоресцентным красителем HEX/VIC.
Если в выделенном образце присутствуют остаточные ингибиторы
ПЦР — полифенолы, жирные кислоты или сахара —
отсутствие сигнала IC позволяет определить невалидность
прогона и исключить выдачу ложноотрицательного результата.
Аналитическое оборудование: BAX® System Q7 и Dualo 32® R2
Компания Hygiena поставляет два типа высокоточных термоциклеров
под различные задачи и объемы исследований:
| Аналитический параметр |
BAX® System Q7
(Automated System) |
Dualo 32® R2
(Compact Real-Time PCR) |
| Формат планшета |
96 образцов (полноразмерный блок 8×12) |
32 образца (4 стрипа по 8 пробирок) |
| Оптические каналы |
5 каналов флуоресценции |
4 независимых канала (FAM, HEX, ROX, Cy5) |
| Скорость нагрева / охлаждения |
До 5.0 °C/сек (элементы Пельтье) |
Высокоскоростной термоблок до 4.5 °C/сек |
| Время прогона реакции |
3.5 часа
(включая стадию плавления)
|
60–85 минут
|
| Программное обеспечение |
Полностью автоматическая выдача
результата «Да / Нет»
|
Количественный учет, графики амплификации,
мультиплекс
|
| Назначение |
Крупные аналитические центры,
агрохолдинги
|
Мобильные лаборатории,
цеховые посты контроля
|
Спектр диагностических направлений наборов foodproof®
Каталог ПЦР-наборов foodproof перекрывает основные направления
пищевой безопасности и производственного контроля:
1. Бактериальные патогены пищевого сырья и готовой продукции
-
foodproof® Salmonella Genus LyoKit:
выявление всех сероваров сальмонелл
(AOAC-RI, MicroVal ISO 16140).
-
foodproof® Listeria monocytogenes LyoKit:
дифференциация опасного для человека вида
L. monocytogenes от непатогенных листерий.
-
foodproof® STEC Screening &
Identification LyoKit:
мультиплексное выявление шига-токсигенных
E. coli по генам
stx1, stx2, eae
и серогруппам O26, O45, O103, O104,
O111, O121, O145 и O157.
-
foodproof® Campylobacter, Vibrio,
Clostridium, Bacillus cereus:
портфель специфических наборов для рыбо-,
мясо- и птицепереработки.
2. Микробиология бродильных производств и напитков
-
foodproof® Beer Screening 1 & 2 LyoKit:
мультиплексное обнаружение более 30 видов
бактерий порчи пива
(Lactobacillus, Pediococcus, Pectinatus,
Megasphaera)
и генов устойчивости к хмелю
horA и horC.
-
foodproof® Spoilage Yeast LyoKit:
выявление диких дрожжей-вредителей
(Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus,
Brettanomyces, Dekkera, Zygosaccharomyces).
3. Скрининг и количественная оценка ГМО
-
foodproof® GMO Screening LyoKit:
детекция регуляторных элементов промотора 35S,
терминатора NOS и промотора FMV.
-
foodproof® Soya / Maize Quantification LyoKit:
вычисление процентного содержания трансгенных линий
сои (Roundup Ready) и кукурузы (MON810)
относительно генов лектина и инвертазы.
4. Видовая идентификация сырья (Animal Identification)
-
foodproof® Animal Identification LyoKit:
мультиплексное определение примеси ДНК свинины,
говядины, птицы — курицы и индейки —
баранины и лошади в мясных полуфабрикатах
для контроля фальсификации и сертификации «Халяль».
Выделение ДНК: наборы foodproof® Sample Preparation
Точность ПЦР напрямую зависит от качества выделенной ДНК.
Hygiena производит серии наборов экстракции под различные
типы пищевых продуктов:
Magnetic Preparation Kits
Выделение на автоматических станциях
с парамагнитными микросферами для получения
ДНК высокой степени чистоты.
Spin Column Kits
Центрифужные спин-колонки с силикагелевыми мембранами
для удаления ингибиторов из шоколада,
пряностей и продуктов с высоким содержанием жира.
ShortPrep Kits
Сверхбыстрое лизирование образца за
15–20 минут
для массового скрининга смывов.
Часто задаваемые вопросы
Совместимы ли наборы foodproof LyoKit с термоциклерами других марок?
Да. Протоколы наборов foodproof LyoKit валидированы
и применяются на открытых термоциклерах сторонних
производителей: Bio-Rad CFX96,
Applied Biosystems 7500, Roche LightCycler 480,
Qiagen Rotor-Gene и ДТ-Прайм
(ДНК-Технология).
Требуется ли стерильный бокс для подготовки образцов?
Да. По стандартам ГОСТ ISO 22174 и санитарным правилам
ПЦР-лаборатория должна быть разделена на три
изолированные зоны: зону пробоподготовки и выделения ДНК,
зону приготовления реакционных смесей
(для LyoKit минимальна) и зону амплификации / детекции.
В чем разница между BAX System Q7 и foodproof Dualo 32 R2?
Система BAX System Q7 ориентирована на стандартизированный
поточный анализ 96 проб с закрытым программным циклом
«Да / Нет» для крупных заводов.
Dualo 32 R2 — универсальный открытый 4-канальный
Real-Time PCR термоциклер на 32 пробы,
позволяющий проводить как качественный анализ,
так и количественные исследования кинетики
амплификации и кривых плавления.
